在基因治療方面，病毒載體通常用於將治療基因傳遞到患者的靶細胞中，以治療遺傳疾病。 腺相關病毒（AAV） 載體是體外基因治療中最著名的病毒載體之一，其研究和開發越來越受到人們的關注。

在本文中，您將了解 AAV 載體在基因治療中的作用，以及為什麼準確的 AAV 載體滴度測試對於安全有效的基因治療產品至關重要。

什麼是基因治療？

 

基因治療代表了現代醫學最具突破性的進步之一，採用一系列策略來改變目標細胞內的基因表達。基因治療不是針對症狀，而是使用病毒或非病毒載體將治療基因傳遞到細胞或組織，以修飾或交換有缺陷的基因。這種策略允許從根本上治療遺傳性疾病，並在治療遺傳性疾病、某些癌症，甚至以前沒有治療選擇的罕見疾病方面顯示出有希望的結果。在過去的 10 年裡，多種基因療法在美國 （FDA） 和歐洲 （EMA） 都獲得了監管部門的批准，標誌著基因醫學的轉捩點。

 

 

 

 

為什麼 AAV 載體如此重要？

 

遞送治療基因最有效的載體之一是腺相關病毒 （AAV）。AAV 是一種無外鞘的單鏈 DNA 病毒，被設計為載體，將治療性 DNA 帶入人體細胞。

AAV載體憑藉其長效基因表現、廣泛的組織靶向性、良好的安全性以及靈活的製備工藝，已成為研究人員的首選工具。重要的是，AAV 是非致病性的，很少整合到宿主基因組中。

 

 

AAV 載體的主要優點

 

長期基因表現：AAV載體能夠持續表達治療基因，時間可長達數年，從而有效解決許多遺傳性疾病的根本原因。

 

不整合到宿主基因組：與某些其他病毒載體不同，AAV通常不會整合到宿主DNA中，從而降低了插入突變的風險，並維持了基因組的完整性。

 

低免疫原性：AAV引起的免疫反應通常較低，這對於長期安全性以及必要時的多次給藥至關重要。

 

組織特異性：不同的AAV血清型具有不同的組織親和力，能夠將治療基因精準地輸送到特定的目標器官。

 

無致病性：AAV對人類無致病性，這增強了基於AAV的基因療法的安全性。高效轉導：AAV載體能夠有效地將基因輸送到目標細胞，即使是那些不活躍分裂的細胞也能實現高效轉導。

 

由於存在多種天然存在的血清型以及經過工程改造的變體，AAV病毒可用於肌肉、肝臟、中樞神經系統或眼部等不同組織的基因傳遞，因此具有廣泛的治療應用潛力。目前，科學家已鑑定出13種不同的人類AAV血清型（AAV1-13），它們分別由不同的包膜蛋白組成。其中，AAV2是研究最深入的血清型。

 

 

應用範例

 

在過去的 10 年裡，美國和歐洲都批准了幾種基於 AAV 的基因療法 ，凸顯了該領域的快速發展。例如，用於治療遺傳性視網膜病變的Luxturna®、用於治療脊髓性肌肉萎縮的Zolgensma®以及用於治療B型血友病的Hemgenix®等產品，已顯著改善了患者的治療效果。這些突破性的療法表明，AAV載體可以用於恢復視力、補充血液凝血功能中缺失的蛋白質，或將拯救生命的基因傳遞給神經元，為此前無法治癒的疾病帶來希望。

 

 

 

AAV載體生產工藝AAV載體的生產涉及以下幾個關鍵步驟：

 

Cell Culture & Transfection細胞培養與轉染

將編碼治療基因、輔助功能蛋白和包膜蛋白的質粒轉染到生產細胞系（通常是HEK-293細胞）。

 

AAV Assembly & Packaging AAV組裝與包裝

在宿主細胞內，治療基因DNA被包裝到AAV包膜蛋白中，形成具有基因傳遞功能的病毒顆粒。

  

Harvesting & Purification萃取與純化

從細胞中提取AAV病毒顆粒，並採用色譜法或密度梯度離心法進行純化，以去除宿主細胞蛋白、DNA和其他雜質。

 

Formulation製劑化

純化的AAV載體經過製劑化處理，即可用於臨床前和臨床試驗。在整個過程中，品質控制（QC）檢測至關重要，用於確保AAV載體的純度、活性和安全性。

 

 

整個過程中，品質控制 （QC） 測試對於確認載體純淨、有效且安全起著至關重要的作用。

AAV基因治療產品品質控制為了確保產品品質和安全性，必須確定關鍵品質屬性（CQAs）。 AAV載體基因組例價是其中一項關鍵品質屬性。在整個生產過程中以及最終產品釋放測試中，必須對AAV載體的特異性和例價進行嚴格檢測。此外，為了確保最終產品的安全性，還必須對潛在的黴漿菌污染和殘留宿主細胞DNA進行嚴格檢測。

 

 

AAV載體例價檢測的重要性在所有必要的品質控制測試中，AAV載體例價檢測特別關鍵，因為它直接影響基因治療產品的劑量準確性。不準確的例價測量可能導致劑量不足或過量，從而降低療效或引發安全隱患。傳統的檢測方法（例如qPCR）容易受到樣品製備差異的影響，並且需要使用標準曲線，而標準曲線的製備依賴於容易出錯的稀釋系列。相較之下，digital PCR技術能夠實現絕對定量，無需標準曲線，從而有效解決了這些問題。這種高精度檢測方法在AAV載體滴度檢測中尤其重要，因為準確的檢測結果對於確定劑量和符合監管要求至關重要。